2000年10月，美国航天飞机宇航员迈克尔·洛佩兹·阿莱格里亚漂浮在国际空间站统一舱外的空间，当时是空间站在地球轨道上组装的早期阶段。
国际空间站宇航员的早期研究工作大多集中在失重环境下的长期生命科学和材料科学调查。在2003年2月哥伦比亚号航天飞机解体后，航天飞机队被停飞，这实际上停止了空间站的扩展。同时，机组人员从3人减少到2人，他们的作用主要限于看守状态，限制了可以进行的科学活动的数量。宇航员们乘坐联盟号飞船飞往和返回国际空间站，空间站由自动的进步号渡船提供服务。
2001年2月16日，从亚特兰蒂斯号航天飞机轨道上拍摄的国际空间站与阿根廷的里奥内格罗河相对照。亚特兰蒂斯号的主要任务是运送 "命运 "实验室舱，在空间站的前端可见。
在航天飞机于2006年恢复定期飞行后，国际空间站的乘员人数增加到3人。同年9月恢复了建设，增加了一对太阳翼和一个热辐射器。欧洲建造的美国节点 "和谐号 "于2007年10月被放置在 "命运号 "的末端。和谐号有一个与航天飞机对接的端口，以及与欧洲实验室哥伦布和日本实验室 "希望 "的连接端口。2008年2月，哥伦布号被安装在和谐号的右舷。哥伦布舱是欧洲第一个长期载人的空间实验室，包含生物学和流体动力学等领域的实验。在接下来的一个月里，阿丽亚娜五号火箭的改进型号发射了欧洲最重的航天器，儒勒·凡尔纳自动转移飞行器（ATV），它携带了7700公斤（17000磅）的物资到国际空间站。同样在3月，航天员带来了加拿大的机器人Dextre，它非常复杂，能够完成以前需要宇航员进行太空行走的任务，还有Kibo的第一部分。2008年6月，"希望 "号的主要部分安装完毕。
2007年10月25日，远征16队指挥官美国宇航员佩吉·惠特森（右）在国际空间站和发现号航天飞机之间的舱门打开后，向STS-120队指挥官美国宇航员帕姆·梅罗伊致意。
国际空间站于2009年5月开始全面运行，当时它开始接纳六人机组；这需要两艘联盟号救生艇始终与国际空间站对接。六人机组通常由三名俄罗斯人、两名美国人和一名来自日本、加拿大或欧空局的宇航员组成。7月，一个外部平台被连接到 "希望 "号的远端，11月，一个俄罗斯对接端口和气闸Poisk被连接到Zvezda舱。2010年安装了第三个节点 "宁静号节点舱"，并在其上安装了一个冲天炉，其机器人工作站和许多窗口使宇航员能够监督外部操作。
国际空间站的示意图，显示了各模块的添加顺序。
在国际空间站建成后，航天飞机于2011年退役。此后，国际空间站由俄罗斯的进步号、欧洲的ATV、日本的H-II转移飞行器和两个商业货运飞行器：SpaceX的龙号和轨道科学公司的天鹅座提供服务。一个新的美国乘员舱，SpaceX的 "乘龙 "号，在2020年首次飞往国际空间站，而波音公司的CST-100 Starliner计划在2021年进行首次载人试飞。在 "乘龙 "号之前，所有宇航员都使用联盟号飞船到达国际空间站。乘龙号载着四名宇航员前往空间站，国际空间站当时能够容纳七名乘员。
2012年5月25日，SpaceX公司的“龙”太空舱与国际空间站对接：这是商业航天器第一次这样做。
来自19个不同国家的200多名宇航员访问过国际空间站。宇航员通常在国际空间站停留约6个月。联盟号返回地球标志着国际空间站远征的结束，国际空间站的指挥权将移交给另一名宇航员。
然而，有几个宇航员在国际空间站停留的时间更长。在一项名为 "太空中的一年 "的特殊任务中，俄罗斯宇航员米哈伊尔·科尔尼延科和美国宇航员斯科特·凯利从2015年3月到2016年3月在轨道上度过了340天。凯利的飞行是美国人最长的一次。由于凯利的哥哥马克是他的同卵双胞胎，而且他自己也是一名前宇航员，科学家们能够以马克为基线，了解长时间的太空飞行对斯科特的影响。
